使用NCBI数据库查询并使用BLAST比对新冠病毒及九种变种的核酸序列

一、实验目的

1. 学会使用NCBI这一常见生物数据库
2. 学会使用比对分析工具BLAST分析核酸或氨基酸序列。

二、实验内容

登录NCBI生物信息站点，查找新冠病毒（COVID-19）和其他几个变种的核酸序列，并利用多序列比对工具（ClustalX）观察说明比对结果；也可以先检索到COVID-19的核酸或氨基酸序列，利用FASTA序列比对数据库搜索工具，检索出其他几种变种的序列，即相似度高的序列，然后进行多序列比对。

三、实验步骤

1，新冠原始病株
首先从NCBI数据库中查询新冠病毒原始病株，查询可知，目前使用的新冠病毒参考序列为NC_045512.2，该序列为2020年1月18日第一株公布出来的新型冠状病毒序列。样品来自武汉采集样本，原始 GenBank accession number 为MN908947，refseq 库 accession number 为 NC_045512.2，长度 29903bp，原始数据为SRR10971381。
参考序列网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512
2，不同地区代表株
由于目前新冠病毒已发表出来的基因组超过 200 多万个样本，其中 NCBI 可以下载的超过78 万，无法对全部数据进行比对分析，并且其中很多序列差别很小，这里我们只随机挑选一些典型突变株作为演示。按照 WHO 最新命名规则，最早于 2020 年 9 月发现于英国的新冠变种病毒（编号 B.1.1.7）被命名为 Alpha；2020 年 5 月发现于南非的新冠变种病毒（编号 B.1.351 ）被命名为 Beta；2020 年 11 月和 4 月发现于巴西的新冠变种病毒（编号分别为 P.1、P.2）分别被命名为 Gamma、Zeta；2020 年 10 月发现于印度的两种新冠变种病毒（编号 B.1.617.2、B.1.617.1）分别被命名为 Delta、Kappa。
WHO 新冠病毒变种株命名规则如下：
https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/
3，查看数据
上述病株id见该网址：
https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/46168526
查询如下：
MN908947（武汉原始病株）
（变种）MZ202314、MZ169911、MZ318159、MZ373479、MZ169912、MW852494、MZ257684、MZ310903、MZ310580
进入NCBI数据库，在搜索框中输入上述id

查看id是否一致，一致则进入该链接

选中GenBank中FASTA（text）项

就会跳转到包含该样本的核酸序列页面，按下ctrl+A即可全选

4，使用BLAST工具进行比对
我们利用NCBI这个网站上的BLAST工具进行新冠病毒核酸全序列的比对工作。（尝试过Clustalx工具，但是全序列有两万九千多碱基对，该工具分析时间过长，且程序会卡住）

选择核酸序列爆破

进入后，将Align two or more sequences选中（默认是选中，没有就勾上）。上下有两个输入框，上面输入原始病株（参考的标本）序列，下面输入几个变种的序列

依次搜索上述id的序列，将原始病株序列粘贴在上方框，九个变种粘贴在下方框（每个粘贴完后换下一行粘贴下一个）

粘贴完后，选择Highly similar…选项，该选项分析的是变种与原始病株的相似性；若需分析不相同序列，请选择More dissimilar…选项。
然后点击下方BLAST，开始分析，得到如下结果

箭头所指即为变种与原始病株的相似度。（相似度计算大概是：用空格填充序列之后，使得该序列与原始序列吻合的碱基对数量占总数量的最大比例）
可以看到，这几个变种与原始病株相似度还是非常高的。都在99.80%以上。按照原始病株的碱基对总数计算，变种的突变碱基对大约在20-50对。

四、实验总结

通过本实验，我们学习了如何在NCBI数据库查询已知id的核酸序列，并以FASTA（text）格式查看数据，以及通过网站自带的BLAST分析工具，对九种新冠病毒变种的序列进行相似度分析。