泰裤辣，神经细胞中居然可以嵌入“年轮”？

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文 | 追问NextQuestion

在《我在岛屿读书》中，作家们看到海中的灯塔，不禁想到弗吉尼亚·伍尔夫的小说《到灯塔去》，并折服于她所写的“她经常感觉到，她不过是一块吸饱了人类各种各样感情的海绵罢了”。而科学家们看到这样的情景感兴趣的是，人们调用这些记忆时，大脑进行的一系列神经活动，如神经元内动作电位的变化、AMPA受体的上膜、相关基因的表达等，以及如何直观地从多尺度对这些活动进行检测。

2023年8月18日，天桥脑科学研究院（Tianqiao and Chrissy Chen Institute，TCCI）和哥伦比亚大学神经技术中心（NTC）、多诺斯蒂亚国际物理中心（DIPC）联合举办了在线学术会议NanoNeuro 2023。本次会议上，来自哈佛大学的Adam E. Cohen教授以**“映射记忆的分子工具（Molecular tools for mapping memories）”为题，从高速生物电动力学、突触可塑性、全脑范围内基因表达的改变**三个方面介绍了其实验室近期围绕记忆过程（不局限于记忆的研究）所开发的一系列分子工具。

捕捉树突树上的“星星”

神经元的树突参与传递两个方向的神经信息。一个方向是从树突到胞体，树突可以整合来自突触的输入信息，确定胞体动作电位时间；另一方向是从胞体到树突。树突也可以整合来自胞体的反向传播动作电位和突触输入信息一起调控突触强度的变化（也就是常说的突触可塑性）。而在任一方向上传播的电信号都会遇到一系列不同的离子通道，这些离子通道会赋予树突以非线性和历史依赖性的动作电位。

那么，树突是如何执行突触输入信息整合和动作电位反向传播这些独特任务的呢？更普遍地说，树突的生物物理学特征和树突双向信息处理功能之间的关系是什么？

人们希望可以在任意空间和时间范围内对神经元施加刺激，然后追踪整个树突树电压的动态变化过程来一探究竟。基于此，Adam E. Cohen教授团队通过整合靶向光遗传学刺激、荧光电压指示器和结构照明显微镜技术，开发了一种可以测量整个树突树电压变化的工具。该工具可对光敏感通道蛋白CheRiff和化学遗传电压指示蛋白Voltron2进行化学修饰，提高其在树突中的表达。

为了验证该工具的可行性，他们在小鼠海马CA1锥体神经元中构建了上述两个基因的双顺反子表达载体，并制备了急性脑片，通过以下步骤制成了高时空分辨率图像。

• 1. 通过双光子显微镜制作高分辨率的结构图像。
• 1. 将光遗传学刺激和结构化照明的高速电压成像（图1，a-b）技术相结合。
• 1. 统筹结构和功能数据，制成高时空分辨率图像。

这种图像可以显示反向传播动作电位的时间和振幅（图1，c-e）。同时也能够以25μs的分辨率揭示了动作电位波面运动的细节（图1，f）。

▷图1：用全光学电生理技术映射锋电位反向传播。图源：参考文献[1]

在后续的实验中，他们发现动作电位在远端树突中的历史依赖性传播是由局部生成的钠离子锋电位（dSpike）驱动的。另外，树突的去极化会引起dSpike的瞬时传播。再者，dSpike与突触输入的整合将触发NMDA受体依赖性高原电位。上述实验结果结合数值模拟，有望在树突的生物物理学特征与突触可塑性之间建立知识连接。

【注】

树突（dendrite）：是神经元解剖结构的一部分，是从神经元胞体发出的多分支突起。树突为神经元的输入通道，其功能是将自其他神经元所接收的动作电位（电信号）传送至细胞本体。其他神经元的动作电位借由位于树突分支上的多个突触传送至树突上。树突在整合这些突触所接收到的信号、以及决定此神经元将产生的动作电位强度上，扮演了重要的角色。

动作电位的反向传播（back-propagating action potential，bAP）：该概念是相较于动作电位的正向传播而言的。动作电位的正向传播即动作电位通常由神经元轴突近胞体端处的轴突起始段启动，沿着轴突向突触前末梢传递；动作电位的传播方式具有双向性，除了从胞体到轴突末梢的正向传播以外，还可以从胞体向树突末梢的方向反向传播。动作电位的反向传播是树突树神经元信号整合和突触可塑性的关键。

树突整合原则（dendritic integration rule）：树突是神经元的主要接收元件。它们的作用就像天线，从成千上万（有时是数万甚至数十万）的突触前输入中获取信息。树突树复杂的几何结构，以及其主动和被动特性，使神经元能够对其输入的信息进行一系列复杂计算。了解单个神经元如何整合它们接收到的数千个突触输入对于理解大脑如何工作至关重要。

关联可塑性原则（associative plasticity rule）：当长时程增强（LTP）诱导高频刺激应用于另一个独立强输入时，在激活的输入中诱导突触传递效能的长期持续增加。在弱输入中，高频刺激（例如100 Hz持续1 s）常不能诱发LTP;然而，当弱输入与另一独立强输入的高频刺激同时被刺激时，弱输入也可以表现出LTP。这种类型的LTP被称为“关联LTP”。

dSpike：为dendritic spike（树突锋电位）的缩写。在本文中，无论在什么位置对神经元施加刺激，锋电位总是从神经元胞体开始，然后传回树突。在胞体处的锋电位具有相似的波形，但远端树突处的锋电位却显示出不同的bAP传播基序。

给新上膜的受体换个颜色

突触强度的改变是学习和记忆的重要组成部分。但哪些突触代表哪些记忆，以及突触强度的变化与其他记忆标记物（如即早期基因的表达）之间的关系，目前尚不明确。为了回答这些问题，Adam E. Cohen教授团队开发了一种新技术，即神经元细胞外蛋白质表面标记（EPSILON），通过用染料标记细胞膜表面AMPA受体，绘制神经元中特定时间窗内的突触强度变化图谱。

以往的研究表明，神经元突触中AMPA受体的密度是突触强度的重要表征。在记忆形成过程中，储存在神经元内囊泡中的AMPA受体会与突触后膜融合，输送到细胞膜上。于是，他们将标记HaloTag（HT）蛋白融合到GluA1的N末端（图2，A），并在神经元中表达HT-GluA1，然后通过直接注射HaloTag配体（HTL）染料（图2，B），与神经元表面的HT-GluA1受体结合。过一段时间后，添加不同颜色的染料来标记新暴露在细胞膜表面的HT-GluA1。因此，不同时间暴露在细胞膜表面的HT-GluA1将会被标记为不同的颜色。如果动物处于学习状态下（图2，C），这一技术将会对动物学习记忆过程前后膜上HT-GluA1的变化进行溯源。最后，使用离体多色成像，将展示大量脑组织和不同脑区AMPA受体胞吐过程的单突触分辨率图谱。

▷图2：EPSILON标记新上膜的AMPA受体。图源：参考文献[5]

海马区对空间记忆形成和存储是必要的，但目前对海马印迹或记忆痕迹的物理学本质仍不清楚，突触水平和细胞水平记忆编码之间的关系也尚不清晰。Adam E. Cohen教授团队基于EPSILON技术，绘制了情境恐惧条件反射下，海马CA1锥体神经元的突触可塑性和cFos基因表达的图谱。相较于对照组，在情景恐惧条件反射的小鼠中，他们发现突触可塑性程度与cFos基因表达水平密切相关。这一发现提示了cFos基因表达与记忆印迹相关的突触分子机制。他们还观察到，与远端突触相比，神经元胞体周围的突触可塑性更强。

上述实验表明，基于AMPA受体的EPSILON技术是研究突触可塑性的有力工具。同时EPSILON技术也有望应用于标记其他跨膜蛋白。

【注】

AMPA受体：α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑受体（也称为AMPAR）是一种谷氨酸能离子型跨膜受体（iGluR），其介导中枢神经系统中的快速兴奋性突触传递。在突触后膜中动态表达，与长时程增强、长时程抑制等生物过程的触发和维持有关，参与调节学习记忆活动。

空间记忆：对环境信息和空间方位的记忆。

情境恐惧条件反射：从操作的角度来看，情境恐惧条件反射可能是最简单的学习形式。将啮齿动物（小鼠）引入新的实验环境中，几分钟后，一次或多次电击其足部。随后，再次返回新环境时，小鼠将依然表现出特征性恐惧行为，即使不再被电击。

即早期基因（Immediate-early genes，IEG）：细胞中一组受到外部刺激后迅速并短暂激活的基因，这些基因的激活不需要其他基因的表达。与之相对的是，一些下游的、需要即早期基因表达产物激活的基因。在神经科学中，即早期基因被广泛用作神经元可塑性的标记物。

在神经元内嵌入彩色“年轮”

生物学长期发展目标之一是绘制生物体内基因的动态表达图谱，这些图谱将有助于揭示大脑活动、胚胎发育或疾病进展等重要生物学过程中基因的时空表达特征。细胞是最小的生命系统，如何实现在细胞内记录特定基因表达的时间窗，也是Adam E. Cohen教授团队好奇的重要科学问题。在自然界中，树木通过一圈又一圈的年轮，记录时间的流逝。那么，在细胞中是否可以同样构建出类似年轮的分子时钟，来映射细胞内特定事件的时间窗呢？为此，他们研发出了在单个细胞内，通过构建蛋白质组装体来记录细胞内历史的分子工具。

这个工具主要由三个部分组成（图3，a-d）。

首先，一个蛋白质支架。这种蛋白质支架可以在哺乳动物细胞中表达，由单链多肽组装形成，晶体结构已知，其延伸不会干扰细胞正常的生理过程，以及可以携带荧光标记并且所携带的荧光标记不会破坏蛋白质支架的整体结构。通过大量的筛选，Pak4激酶催化结构域与其抑制剂Inka1的氨基酸iBox结构域所形成的融合蛋白是实验中理想的蛋白质支架的元件（以下称为iPAK4），其可以在细胞内稳定地组装成杆状晶体。

其次，一种可以将蛋白质支架的长度与外部世界时间校准的方法。使用HT（HaloTag）与iPAK4的融合蛋白，可以构建基准时间戳。不同颜色的HT配体染料交替注射可以产生颜色边界，其位置将对应已知的时间。

最后，可以稳定地结合到支架中，具有转录活性的eGFP荧光报告基因。通过测量蛋白质支架上eGFP标记相对于基准时间戳的位置，可以大致推断感兴趣的基因转录的时间。

随后，Adam E. Cohen教授团队在HEK细胞和小鼠海马神经元中，对cFos基因的启动子的转录激活进行了记录，证明了该系统的有效性。

▷图3：胞内iPAK4蛋白支架。图源：参考文献[6]

工欲善其事，必先利其器。人们对世界的认识，离不开日新月异的技术的发展。Adam E. Cohen教授团队研发的一系列分子工具，将有助于开展对记忆等生物学过程中神经活动的监测。未来，神经技术的突破也将助力大脑奥秘的揭露。

** 参考文献**

• [1] Park P, Wong-Campos D, Itkis DG, Qi Y, Davis H, Grimm JB, Plutkis SE, Lavis L, Cohen AE. Dendritic voltage imaging reveals biophysical basis of associative plasticity rules. bioRxiv [Preprint]. 2023 Jun 2:2023.06.02.543490. doi: 10.1101/2023.06.02.543490. PMID: 37398232; PMCID: PMC10312650.
• [2] Gasparini, S., Migliore, M. (2019). Action Potential Back-Propagation. In: Jaeger, D., Jung, R. (eds) Encyclopedia of Computational Neuroscience. Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-7320-6_123-5
• [3] Stuart, G., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci 18, 1713–1721 (2015). https://doi.org/10.1038/nn.4157
• [4] Manabe, T. (2008). Associative Long-Term Potentiation. In: Binder, M.D., Hirokawa, N., Windhorst, U. (eds) Encyclopedia of Neuroscience. Springer, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-540-29678-2_391
• [5] Kim D, Park P, Li X, Wong Campos JD, Tian H, Moult EM, Grimm JB, Lavis L, Cohen AE. Mapping memories: pulse-chase labeling reveals AMPA receptor dynamics during memory formation. bioRxiv [Preprint]. 2023 May 29:2023.05.26.541296. doi: 10.1101/2023.05.26.541296. PMID: 37292614; PMCID: PMC10246012.
• [6] Lin D, Li X, Moult E, Park P, Tang B, Shen H, Grimm JB, Falco N, Jia BZ, Baker D, Lavis LD, Cohen AE. Time-tagged ticker tapes for intracellular recordings. Nat Biotechnol. 2023 May;41(5):631-639. doi: 10.1038/s41587-022-01524-7. Epub 2023 Jan 2. PMID: 36593408; PMCID: PMC10192119.

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